1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu thu tại hiện trường được cho vào bình chứa vô trùng, giữ lạnh và mang về phòng thí nghiệm, bảo quản ở 40C cho đến khi xử lý (không quá 3 ngày). Các mẫu được thu từ các ao tôm khỏe mạnh gồm mẫu bùn, nước ao nuôi và mẫu tôm tại các huyện Đức Phổ, Mộ Đức và Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi.
2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
a. Phương pháp phân lập và định danh hình thái vi khuẩn Bacillus
Phân lập vi khuẩn Bacillus dựa trên đặc tính sinh bào tử chịu nhiệt độ cao của các loài thuộc chi Bacillus. Mẫu được ủ ở 800C trong 2 giờ và thực hiện pha loãng bậc 10, cấy trải trên môi trường Tryptone casein soy agar (TSA), ủ 370C trong 24 giờ. Cấy chuyền làm thuần các khuẩn lạc đơn đặc trưng và kiểm tra các thử nghiệm hình thái – sinh hóa theo khóa phân loại Bergey, bao gồm nhuộm Gram, nhuộm nội bào tử, thử catalase.
b. Phương pháp phân lập và định danh hình thái vi khuẩn lactic
Phân lập vi khuẩn lactic dựa trên khả năng sinh axit làm tan CaCO3 trên môi trường thạch. Mẫu được pha loãng bậc 10 và trải trên môi trường de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) có chứa CaCO3 0,5% trong 48 giờ. Những khuẩn lạc tạo vòng tan CaCO3 sẽ được cấy chuyền làm thuần sang môi trường MRS và kiểm tra các đặt tính hình thái – sinh hóa theo khóa phân loại Bergey, gồm nhuộm Gram, thử catalase, khả năng phát triển ở pH 4,4 và 9,6, khả năng phát triển ở nồng độ muối 6,5% và 18%, khả năng phát triển ở 100C và 450C, khả năng sinh khí trong quá trình lên men.
Nguồn mẫu phân lập được chọn từ nước ao tôm và từ tôm ở các ao nuôi không có dịch bệnh, có năng suất cao ổn định liên tục trong ít nhất 4 vụ tôm gần đây.
3. Phương pháp đánh giá tiềm năng probiotic
a. Phương pháp đánh giá khả năng tiết amylase ngoại bào
Hoạt tính amylase được thực hiện bằng cách cho dịch nuôi cấy phản ứng với tinh bột tan để tạo thành đường khử và xác định hàm lượng đường khử bằng phản ứng màu với DNS. Hỗn hợp phản ứng sau đó được đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm để xác định hàm lượng đường khử, từ đó tính toán hoạt độ amylase tương ứng.
b. Phương pháp đánh giá khả năng tiết protease ngoại bào
Đánh giá hoạt độ của protease ngoại bào bằng phương pháp Anson cải tiến. Cho dịch nuôi phản ứng với dung dịch casein, protease sẽ phân hủy casein tạo thành nhiều tyrosine, chất này tạo màu khi phản ứng với thuốc thử Folin và sử dụng máy đo quang phổ để xác định hàm lượng tyrosine tạo thành, từ đó quy đổi ra hoạt độ enzyme tương ứng.
c. Phương pháp đánh giá khả năng kháng kháng sinh
Khả năng kháng kháng sinh được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và xác định MIC của kháng sinh bằng phương pháp nuôi cấy lỏng và đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm.
d. Phương pháp đánh giá khả năng sinh axit
Khả năng sinh axít được đánh giá bằng pH dung dịch, sử dụng máy đo pH.
e. Khả năng kháng Vibrio
Khả năng kháng Vibrio được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
f. Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn có tiềm năng
Vi khuẩn được định danh bằng phương pháp giải trình tự RNA ribosome tiểu phần 16S và sử dụng công cụ BLAST để đối chiếu, so sánh với cơ sở dữ liệu GENBANK của NCBI và định danh, xây dựng cây phân loại.
4. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của chủng vi sinh vật có tiềm năng
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và phương pháp cấy trải, đếm khuẩn lạc.
Các yếu tố được khảo sát gồm: nhiệt độ, tốc độ lắc, mật độ cấy giống ban đầu, pH ban đầu, nguồn C (đường glucose, sucrose, tinh bột mì, cám gạo), nguồn N (peptone, bột đậu nành), thành phần khoáng chất và vitamin.
5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê mô tả (tính trung bình, độ lệch chuẩn) và xử lý ANOVA một nhân tố bằng phần mềm Graph Prism 8.3.0.
